KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE
Cílená metabolomika Agilent vyvinul kompletní postup, který kombinuje přípravu vzorků na robotické platformě Agilent Bravo a jejich měření na systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC a trojitém kvadrupólu 6495. Metoda obsahuje také databázi optimalizovaných MRM přechodů pro 500 metabolitů, zahrnující i polární molekuly, jako jsou aminokyseliny, koenzymy, tri- karboxylové kyseliny a produkty glykolýzy. Příprava vzorku je realizována na Agilent Bravo metabolomické platformě ve formátu jamkových destiček. Ve vzorcích plazmy nebo buněčného lyzátu se nejprve precipitují proteiny, které se následně spolu s lipidy odstraní na SPE destičce se sorbentem Agient Captiva EMR Lipid. Vzorky se odpaří (mimo robot) a vrací se do Agilent Bravo na rekonstituci do finálního rozpouštědla. K chromatografické separaci se využívá Agilent 1290 Infinity II Bio LC s kolonou Poroshell 120 HILIC-Z. Biokompatibilní UHPLC systém je vyroben ze slitiny MP35N, která neobsahuje železo a její inertnost leží hned za titanem. Mechanická a tlaková odolnost je stejná jako u stan- dardního UHPLC z nerezové oceli. Na Bio LC systému lze dosáhnout dobrého tvaru píku a reprodukovatelného měření i pro chromatograficky problematické analyty interagující s kovy, jako jsou aminokyseliny, poly- karboxylové kyseliny a fosforylované metabolity – viz obr. 5. Obr. 5: A – Chromatografické tvary píků polárních metabolitů; B – Se- parace a opakovatelnost retenčních časů leucinu a isoleucinu, překryv chromatogramů ze 160 nástřiků extraktů plasmy.
Obr. 3: Histogram opakovatelnosti plochy píku v metodě s 0,5 ms dwell time
Rozsah m/z vás neomezí Elementy vstupní iontové optiky jsou zodpovědné nejen za přenos iontů do vakua, ale také ovlivňují m/z rozsah hmotnostního spektrometru. Vstupní optika musí účinně transportovat jak ionty s nízkým, tak i vysokým m/z. U nejcitlivějších LC/MS trojitých kvadrupólů se právě kvůli kompromisu mezi transmisí iontů a rozsahem m/z často setkáme s omezením horní hranice hmotnostního rozsahu okolo m/z 2000, někdy i nižším. Díky patentovanému designu iFunnel nemusí Agilent volit mezi citlivostí a rozsahem m/z, proto LC/MS systém 6495D disponuje ve své kategorii zcela unikátním hmotnostním rozsahem až do m/z 3000. To jej předurčuje pro náročné aplikace i v oblasti větších molekul, jako I přes všechna opatření se samozřejmě stane, že je čas od času potřeba vyčistit iontový zdroj a vstup iontů do MS. Všechny nové hmotnostní spektrometry Agilent jsou vybaveny izolačním ventilem „VacShield“ pro možnost čištění vstupní kapiláry bez vypínání a zavzdušnění přístroje, viz obr. 4. Obr. 4: A – Technologie VacShield umožňující automatické uzavření vakua při čištění vstupní kapiláry; B – Vyjmutí kapiláry je usnadněno použitím speciálního nástroje. jsou peptidy nebo některé lipidy. Snadné čištění vstupní optiky
Přístrojová inteligence Agilent 6495D se připojil do rodiny „inteligentních“ LC/MS. Ve spolu- práci s novým akvizičním SW Agilent MassHunter 12 tak nabízí celou řadu nových vlastností a funkcí: • Ladění SWARM (= angl. roj včel) je multiparametrový iterační algo- ritmus optimalizace prvků iontové optiky, díky němuž je společné optimum nalezeno rychleji a kvalitněji. • Upozornění na včasnou údržbu (Early Maintainance Feedback, EMF) a autodiagnostika. • Funkce Inteligentní Reflex zajišťuje podmíněnou logiku nástřiků. Sekvence se může automaticky upravit podle výsledků předchozí analýzy. • Automatická optimalizace MRM přechodů a paramerů iontového zdroje je nyní nedílnou součástí MassHunter 12 akvizičního SW. Optimalizace probíhá automaticky opakovanými nástřiky z vialky, což je výhodnější oproti ladění z infuze díky výrazně nižší spotřebě (často drahých) standardů, a také nedochází ke zbytečné kontaminaci systému cílovými analyty. V případě použití chromatografické kolony algoritmus naladí i látky se stejnou hmotou prekurzoru, které se chromatograficky separují.
Pro detekci je použit hmotnostní spektrometr Agilent 6495 a metabo- lomická databáze zahrnující 500 látek s plně optimalizovanými MRM přechody. Validace metody ukázala, že kvantitativní a citlivá detekce metabolitů je možná už při dwell time okolo 1 ms, což umožňuje i profilování všech 500 metabolitů. Lze zvolit různé přístupy k měření: a) profilování všech metabolitů na 1 MRM přechodu; b) profilování užší skupiny cílených metabolitů na více přechodech; c) kvantitativní analýza s využitím izotopově značených standardů od Cambridge Isotope Laboratories. Kompletní popis metabolomického řešení je v aplikační poznámce od společnosti Agilent [1].
13
CHEMAGAZÍN • 2 / XXXIV (2024)
Made with FlippingBook. PDF to flipbook with ease