KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE
Závěr Nový Agilent 6495D opět zvedl pomyslnou laťku přístrojů typu LC/MS trojitého kvadrupólu z hlediska výkonu a uživatelských funkcí. Možnost měření velkého počtu látek v metodě s vynikající opakovatelností a citli- vostí i za podmínek velmi nízkých dwell time spolu s odolností matriční zátěži předurčují tento přístroj k využití v cílených „omics“ metodách. Agilent v posledním roce uvedl předpřipravené postupy a LC/MS metody pro cílenou metabolomiku, lipidomiku a proteomiku s využitím tohoto nejvyššího modelu LC/MS trojitého kvadrupólu. Laboratoř tak může ušetřit zdlouhavý vývoj metod a daleko rychleji tak být připravená na rutinní měření vzorků. Literatura [1] Karen E. Yannell et al., An end-to-end targeted metabolomics work- flow, Agilent aplikační poznámka 2023. [2] Kevin Huynh et al., A comprehensive, curated, high throughput method for the detailed analysis of the plasma lipidome, Agilent aplikační poznámka 2021. [3] Kevin Huynh et al., High-throughput plasma lipidomics: Detailed mapping of the associations with cardiometabolic risk factors, Cell Chem. Biol. 2019, 26(1), 71–84.e4. [4] Linfeng Wu et al., Peptide quantification in plasma using the Agilent 6495 triple quadrupole LC/MS coupled with the Agilent 1290 Infinity II LC System, Agilent aplikační poznámka 2020. [5] Nicolas Eskenazi et al., Quantification of Frataxin-M Protein, a blood biomarker of the rare disease Friedreich’s Ataxia using the Agilent 6495 triple quadrupole LC/MS system, Agilent aplikační poznámka 2023. [6] Linfeng Wu et al.,Robust and Reproducible Protein Quantification in Plasma using the Evosep One and the Agilent 6495 Triple Quadru- pole LC/MS, Agilent aplikační poznámka 2023.
Cílená lipidomika Profilování lipidů je další z aplikací, kdy je nezbytné změřit velké množ- ství analytů v jedné analýze. Agilent ve spolupráci s Baker Heart and Diabetes Institute v Melbourne vyvinul řešení pro cílenou lipidomiku, umožňující cílené stanovení 763 lipidů z extraktu plasmy s celkovou dobou analýzy 16 min. Příprava vzorku se provádí extrakcí směsí buta- nol-metanol (1:1) s přídavkem 10 mM mravenčanu amonného, přičemž do extrakčního rozpouštědla je přidána směs vnitřních standardů. Analytická metoda zahrnuje separaci na koloně s reverzní fází Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 a detekci pomocí LC/MS trojitého kvadrupólu 6495. Akviziční metoda využívá dynamické MRM s přepínáním polarity a zahrnuje 763 lidských lipidů z 44 tříd. Podobně jako v metabolomické metodě, i tato měřicí metoda je velmi náročná na rychlost hmotnostního spektrometru, v nejfrekventovanější oblasti chromatogramu se měří 115 přechodů současně, což vede k dwell time nižšímu než 2 ms. I za těchto podmínek jsou získána kvantitativní data, jak je patrné z histogramu relativních směrodatných odchylek na obr. 6. Kompletní popis uvedené lipidomické metody je v aplikační poznámce [2] a v publikaci [3]. Obr. 6: Histogram variačních koeficientů lipidů z různých QC vzorků měřených v jedné sekvenci
Přesné, spolehlivé a plně programovatelné peristal�cké pumpy
Cílená proteomika Proteomická příprava vzorku, podobně jako u metabolomiky, může být plně automatizována na robotické platformě Agilent Bravo, která nabízí předpřipravené postupy pro jednotlivé kroky přípravy vzorku nebo jejich kombinaci (například zakoncentrování proteinů, enzymatická hydrolýza, přečištění peptidů…). Řešení pro cílenou proteomiku Agilent zahrnuje citlivé a kvantitativní stanovení proteinů PeptiQuant kitu (MRM proteomics) zahrnující 270 proteinů lidské plazmy [4]. Metoda je založena na UHPLC separaci za standardních průtoků s iontovým zdrojem Agilent Jet Stream. Měření na systémech se standardním průtokem je oproti nano LC systémům vhodnější pro studie s velkými počty vzorků, a to jak z hlediska robust- nosti systému, tak i významně lepší propustnosti vzorků díky kratšímu času analýzy. Díky vysoké citlivosti trojitého kvadrupólu Agilent 6495 a schopnosti měřit velký počet MRM přechodů v jedné metodě je dosaženo mezí kvantifikace srovnatelné s nano LC technikou ve spojení s HRMS v režimu monitoringu paralelních reakcí (PRM), přičemž linearita a opakovatelnost dosahovaná na Agilent LC/MS QQQ systému je lepší [5]. Pro rozsáhlé klinické studie, kde je kladen důraz na malou spotřebu vzorku a na standardizované robustní řešení, je možné využít také spojení nano LC Evosep One s Agilent 6495 trojitým kvadrupólem. Tato „high- -throughput“ metoda využívá automatického rychlého odsolení vzorku ve špičce se sorbentem a následující gradientová eluce přenese peptidy z této špičky na nanoLC kolonu [7]. Narozdíl od klasického nano LC jsou gradienty rychlejší, doba analýzy kratší a systém je významně robustnější. Pro vývoj metod a vyhodnocení dat slouží software Skyline, který je plně integrován s Agilent MassHunter SW.
SÉRIE 9000
NE-9000G 0.004 – 75.19 mL/min
NE-9000B 0.035 – 775.2 mL/min
NE-9010 0.081 – 1 500 mL/min
NE-9004C 0.047 – 1 038 mL/min
14
CHEMAGAZÍN • 2 / XXXIV (2024)
Made with FlippingBook. PDF to flipbook with ease