KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE
Obr. 3: Elektronově mikroskopický snímek stacionární fáze s porézním povrchem a neporézním centrem. (Obrázek poskytnut laskavostí Dr. J. Kirklanda).
Zcela nový formát chromatografických separačních jednotek přišel na svět s použitím mikroobráběcích technologií zděděných z oblasti výroby čipů. První příklad takového separačního čipu, vyrobeného mikroob- ráběním křemíkových destiček a zobrazeného na obr. 4A, představil F. Regnier již v roce 1998 a použil ho pro kapilární elektrochromato- grafii [11]. Později tuto technologii teoreticky i prakticky podstatně rozvinul G. Desmet [12]. Vývoj směřující k dalšímu zvýšení účinnosti stále probíhá. Oproti plněným kolonám je zde k dispozici větší počet proměnných, které lze kontrolovat, jak prokázala Desmetova skupina. Mezi ně patří např. tvar a výška sloupků, jež mohou mít libovolné prostorové uspořádání a jejichž průřez může mít prakticky jakýkoliv geometrický tvar. Zřejmě kolony plněné částicemi toto neumožňují. Obr. 4B ukazuje příklad struktury obsahující sloupky s roztaženým šestiúhelníkovým průřezem připomínajícím kajak, který při průtoku shora dolů produkoval nejvyšší účinnost při HPLC separaci [13]. Za zdůraznění stojí fakt, že tato separační zařízení lze navrhovat s použitím počítačových programů, aniž by se muselo rozsáhle experimentovat, a teprve optimalizovaný design pak vyrobit. Komerční provedení jed- nodušší jednotky plochého, téměř dvoudimenzionálního formátu, je ukázané na obr 4. C–E. K rychlé separaci s použitím reverzně fázového mechanismu v něm dochází ve vrstvě obsahující sloupky ve tvaru válců, na jejichž povrchu jsou navázány C18 řetězce. S. Eeltink rozšířil mikrofluidní chromatografickou technologii do ob- lasti vícedimenzionálních separací [14]. Jeho nejnovější „čip“, ukázaný na obr. 5, určený k separaci bílkovin, zahrnuje kanál napříč systémem umožňující separaci isoelektrickou fokusací v první dimenzi, 64 dalších podélných kanálů pro separaci vylučovacím mechanismem ve druhé di- menzi a konečně 4096 vertikálních kanálů pro reverzně fázovou separaci ve třetí dimenzi. V kanálech druhé a třetí dimenze umístil monolitické stacionární fáze připravené in situ polymerizací s použitím fotomasek. Jeho systém vykázal píkovou kapacitu pozoruhodných 32 600 za dobu analýzy pouhých 44 min. Obr. 5: Fotografie prototypu chipu určeného k separaci ve třídimenzio- nálním prostoru (3D separace) využívající jeden separační kanál v první dimenzi, 64 ve druhé a 4096 kanálů ve třetí [14].
Podstatnou součástí chromatografického separačního procesu je difuze dělených molekul v pórech stacionární fáze. Rychlost difuze je nepřímo úměrná velikosti molekul. Proto je separace velkých molekul, jako jsou bílkoviny, nukleové kyseliny či syntetické polymery, s použitím typických kolon pomalá. Protože rychlost difuze nelze snadno změnit, řešením k urychlení separací je zkrátit vzdálenost, po kterou musí molekuly difundovat. Toho lze dosáhnout zmenšením velikosti částic, leč na úkor růstu tlakového spádu, jak bylo uvedeno výše. Alternativně bylo ovšem možné ponechat velikost částic větší, a tak neovlivnit tlak v systému, zatímco byla změněna struktura samotných částic. Namísto plně porézních částic byly použity částice, jejichž střed je neporézní a je pouze obalený porézní vrstvou. Elektronově mikroskopický snímek takové částice se slinutým jádrem ukazuje obr. 3 [8]. Obr. 4: Elektronově mikroskopické snímky separačního mikročipu vyro- beného na skleněné destičce [11] (A), čipu obsahujícího sloupky s roz- taženým šestiúhelníkovým průřezem [12] (B) a komerční mikrofluidní separační HPLC jednotka 200 µPAC firmy PharmaFluidic (D–E).
Mikrofluidní čip může rovněž obsahovat více paralelních kanálů, v nichž separace probíhají souběžně. Paralelizmus umožňuje významně zvýšit produktivitu zejména v oblastech vyžadujících separace velkých počtů vzorků, jako je tomu např. v klinické diagnostice. Kromě toho takový čip může obsahovat i celou řadu dalších modulů umožňujících např. extrakci, modifikační reakci, či in situ detekci. Masové rozšíření závisí na tom, podaří-li se dotáhnout tento koncept laboratoře na čipu do úspěšného konce. Použití čipů v multidimenzionální chromatografii pak dovolí kvalitní separace komplexních vzorků za významně kratší dobu v porovnání s klasickým sekvenčním přístupem. Na tomto místě nelze rovněž nevzpomenout ani přístupu k získávání zařízení pro chromatografické separace, aditivní výrobu, při níž se
Kvalitativní změnou v oblasti stacionárních fází se stalo zavedení mo- nolitických kolon na začátku devadesátých let minulého století. Nejprve byly představeny tyto kolony připravované z organických polymerů [9] následované kolonami obsahujícími monolit ze siliky [10]. Významnou výhodou monolitických kolon obojího typu se ukázala být jejich značná externí porozita. Zatímco mezičástečková porozita kolon naplněných sférickými částicemi je vždy zhruba 40 %, v monolitech ji lze snadno nastavit v širokém rozmezí až do 90 %. Významně větší póry pak umož- ňují použití daleko menších tlaků k dosažení i značných průtoků, což vede k významnému zrychlení separací i velkých molekul. Nicméně, monolitické kolony si rovněž zachovávají typický tubulární formát.
9
CHEMAGAZÍN • 2 / XXXIV (2024)
Made with FlippingBook. PDF to flipbook with ease