KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE
KAM SE UBÍRAJÍ STACIONÁRNÍ FÁZE PRO CHROMATOGRAFICKÉ KOLONY
ŠVEC F. Katedra analytické chemie, Farmaceutická fakulta, Univerzita Karlova, Hradec Králové, svecfr@faf.cuni.cz
Chromatografie byla vynalezena ruským botanikem M. S. Cvětem. Po testování desítek různých pevných látek a rozpouštědel sestavil zařízení ukázané na obr. 1, které mu umožnilo rozdělit směs chlorofylů a xantofylů z petroléterového extraktu listů hluchavky bílé. Ve své publikaci z roku 1906 napsané v němčině uvedl [1]: “ Stejně jako světelné paprsky ve spektru se různé složky směsi barviv oddělují v koloně uhličitanu vápenatého a lze je kvalitativně a kvantitativně stanovit. Takovému zobrazení říkám chromatogram a tomu odpoví- dající metodě, metoda chromatografická. “ Jeho jednoduchá kolona byla naplněna nepravidelnými částicemi anorganického materiálu, který reprezentoval první popsanou stacionární fázi. Podle jedné z verzí nazval svoji metodu chromatografií podle rozdělení barevných látek ve své koloně, neboť chroma v řečtině znamená barva. Cvět ovšem značně předběhl dobu a jeho metoda byla po celých dvacet let prakticky zapomenuta.
Během druhé světové války zatím tajně a po ní i veřejně začala chro- matografie nabírat na otáčkách. Zcela samozřejmě vývoj separačních kolon stál v popředí vývoje. Jak již naznačili Martin a Synge, „ … nejmenší HETP by mělo být dosažitelné použitím velmi malých částic a vysokého tlakového rozdílu po délce kolony …. “ Účinnost jejich kolon byla však nevalná, jak ukazuje tabulka v obr. 2, původně sestavená R. Majorsem [5]. Ke zlomu došlo s vývojem vysokoúčinné kapalinové chromatogra- fie (High Presure Liquid Chromatograpy, HPLC), který je připisován C. Horváthovi [6]. Ten použil 50 µm skleněné sférické částice pota- žené vrstvou poly(styren-co-divinylbenzenu) a následně modifikovanou chlormetylací a reakcí s dimetylbenzylaminem. Horváth pro tento typ stacionární fáze také vymyslel název pelikulární a použil ji pro, do té doby nevídané, separace nukleotidů. Obr. 2: Historie vývoje komerčních stacionárních fází pro HPLC. (Adap- továno z reference [5]).
Vzkříšena byla maďarskými vědci L. Zechmeisterem spolu s L. Chol- nokym a jejich publikace z roku 1927 popsala jednoduchou separaci barviv z paprikových lusků [2]. O něco později pak R. Kuhn a E. Lederer v Německu použili podobný postup pro separaci karotenů [3]. Práce obou těchto týmů se inspirovala Cvětovými pracemi. Pro metodu použili jeho název chromatografie. Mechanismus separace spočíval na rozdílně silné interakci dělených látek rozpuštěných v organickém rozpouštědle s povrchem pevné fáze. V dnešní terminologii bychom jejich mechani- smus nazvali adsorpční kapalinovou chromatografií. Obr. 1: Schéma prvního chromatografu: 1 – manometr, 2 – zásobník tla- ku, 3 – nádobky na roztoky vzorků a naplněné kolony, 4 – ruční pumpa, 5 – kolona obsahující rozdělené chlorofyly a xantofyly z petroletherového extraktu listů hluchavky bílé ( Lamium album ) [1].
Na počátku čtyřicátých let minulého století A.J.P. Martin a R.L. Synge aplikovali tuto metodu na rozdělení aminokyselin získaných bazickou hydrolýzou ovčí vlny [4]. Jako stacionární fázi použili nepravidelné částice silikagelu, který si sami vyrobili z vodního skla. Póry tohoto materiálu naplnili vodným roztokem acidobazického iniciátoru. Jako mobilní fázi, v níž rozpustili dělený vzorek, použili 1% roztok 1-butanolu v chloroformu. Separaci pak detekovali vizuálně ze změny barvy inici- átoru v jednotlivých pásech, v nichž byly jednotlivé kyseliny přítomny. Využili přitom mechanismus známý jako rozdělovací kapalinová chro- matografie. Jakkoliv je separace acetylovaných aminokyselin dozajista zajímavá, daleko větší význam má první část této publikace nazvaná „A Theory of Chromatography“. Tam poprvé zpracovali chromatografii v plněných kolonách z hlediska jiného dělicího procesu, kolonové desti- lace, a zavedli do chromatografie pojem výška ekvivalentní teoretickému patru (HETP) dodnes používaný pro vyjádření účinnosti kolon. Rovněž ukázali, které charakteristiky tuto účinnost ovlivňují. Za tento pionýrský počin jim pak byla v roce 1952 udělena Nobelova cena.
Kolonové technologie se od té doby vyvíjely zejména pozvolným zmenšováním velikosti částic stacionárních fází. Ty se dostaly od něko- lika desítek mikrometrů na počátku HPLC na velikost menší než 2 µm v posledních dvou desetiletích. To samozřejmě vedlo k významnému zvýšení účinnosti ale současně i k růstu tlakové ztráty. Jinými slovy, k docílení požadovaného průtoku je třeba použít systém, jehož čerpadla produkují vysoký tlak. Proto byly od roku 2004 uváděny na trh systémy UHPLC (Ultra HPLC), které v dnešní době umožňují pracovat s tlaky až 150 MPa. Další zmenšování velikosti náplní kolon se nezdá být zatím v dohledu. Jedním z důvodů může být i skutečnost, že tlak v koloně, jako jedna forma energie, se přeměňuje na teplo jako jinou formu energie a vznikající gradient teploty pak negativně ovlivňuje kvalitu separace [7].
8
CHEMAGAZÍN • 2 / XXXIV (2024)
Made with FlippingBook. PDF to flipbook with ease