VÝVOJ LÉČIV
ZVÝŠENÍ EFEKTIVITY METODIKY DROP-SEQ TECHNOLOGIÍ SENSIFIC ODIN Sensific GmbH, Biberach an der Riß, www.sensific.de
Lidské tělo obsahuje bilióny buněk, které všechny obsahují identickou DNA, a přesto vykazují různé funkce. Této buněčné heterogenitě lze lépe porozumět díky analýze RNA než sekvenováním DNA. Single-cell RNA sekvenování (scRNA-Seq) přineslo do této úlohy revoluci, ve které se Drop-seq ukazuje být základní metodikou. Drop-seq používá kapičkovou mikrofluidiku pro enkapsulaci jednotlivých buněk s funkcionalizovanými mikročásticemi do nanolitrových kapiček, které umožňují RNA analýzu s vysokou propustností. Bez ohledu na své výhody, skrývá Drop-seq výzvy, jako jsou nízká výtěžnost a problém s monitorováním enkapsulačního procesu.
Obr. 1: Znázornění enkapsulačního procesu v křížení a následná homo- genizace v modifikovaném Drop-seq kanálu. Olej se surfaktantem proudí shora a zdola, zatímco buňky v buněčném médiu smísené s mikročásti- cemi v lyzačním pufru vstupují zleva. Kapičky se v kapalině dále homoge- nizují průtokem meandrovitým kanálem.
Technologie firmy Sensific napomáhá k řešení těchto limitů zvýšením účinnosti a rozlišení metodiky Drop-seq. Senzor nabízí optimální mo- nitorování procesu, umožňuje přímé řízení rychlosti tvorby kapének a jejich distribuce. Tato technologie eliminuje závislost na statistické enkapsulaci, zajišťuje téměř 100% čistotu díky identifikaci a vytřídění správně vytvořených kapiček v reálném čase. Díky tomu integrace pří- strojů Sensific výrazně zvyšuje přesnost a propustnost jednobuněčné transkriptomiky stejně jako mnoha dalších aplikací a nabízí robustní řešení pro analýzy buněk. Tento pokrok nejen zjednodušuje nastavení experimentů, ale také obohacuje populace požadovaných kapiček, což může pomoci přinést výrazný posun v oblasti biotechnologie. Výzvy pro technologii Sensific Lidská bytost se skládá z biliónů buněk s řadou různých funkcí. Avšak všechny tyto buňky každého jedince obsahují stejnou DNA. Proto nám DNA sekvenování nemůže poskytnout informaci o heterogenitě buněk, jejich funkcích nebo o regulování populací buněk, tyto informace nám může poskytnout RNA, vytvořená procesy transkripce a translace z molekuly DNA. RNA jednotlivých buněk může být studována s pomocí jednobuněčné transkriptomiky (single-cell RNA sequencing scRNA-Seq). V úvodních krocích scRNA-Seq je potřeba manuálně izolo- vat jednotlivé buňky, které jsou pak sekvenovány. Tento proces je časově i finančně náročný. Před několika lety přinesla převrat do tohoto pro- cesu metodika Drop-seq, “metodika, která analyzuje informaci mRNA tisíců jednotlivých buněk díky jejich uzavření do drobných kapiček pro paralelní analýzu” [1]. Drop-seq využívá výhody kapičkové mikroflui- diky, fascinující a špičkové oblasti biotechnologie, kde každá kapička slouží jako nanolitrová reakční komora. Tyto reakční komory mohou být vytvářeny rychlostí několika tisíc za sekundu, což výrazně zkracuje experimentální čas při současném dramatickém zvýšení propustnosti [2]. Drop-seq se stala populární a široce využívanou metodou díky tomu, že je plně zdokumentovaná, volně přístupná a snadno implementovatelná. Základními prvky této metody jsou mikrofluidní čip, který umožňuje enkapsulaci jednotlivých buněk s jednotlivými funkcionalizovanými mikročásticemi do kapiček vody v oleji (obr. 1). Druhým klíčovým prvkem jsou mikročástice, které jsou rozptýleny v lyzačním pufru a jsou funkcionalizovány sekvencemi oligonukleotidů. Tyto sekvence obsahují, mimo jiné, skupiny k zachycení RNA a pro přiřazení příslušných RNA molekul jejich původním buňkám. Krátce po enkapsulaci je buněčná membrána vystavena lyzačnímu pufru, čímž se buněčná stěna naruší a uvolní se RNA, takže se buňka může navázat na mikročástici. Tento enkapsulační proces probíhá stochasticky a je při něm generováno několik tisíc kapiček za sekundu. RNA navázaná na mikročástice ve všech zachycených kapičkách může být pak simultánně přepsána do cDNA, zesílena PCR a nakonec sekvenována. Sekvence oligonukleotidů pak umožňují přiřadit jednotlivou molekulární RNA jejich původním molekulám a kvantifikovat je. Pro dosažení maximálního možného rozlišení je potřeba zamezit enkapsulaci více buněk společně s jednou mikročásticí. Ale protože metoda spoléhá na statistický enkapsulační proces, musí být udržována velmi nízká koncentrace, díky čemuž je pouze asi 1 % buněk enkap- sulováno s mikročásticí, a tudíž i sekvenováno. To vede k velmi nízké výtěžnosti, a přitom stále zůstává možnost, že bude enkapsulováno více buněk společně v jedné kapičce. Další výzvou je složitost monitorování enkapsulačního procesu.
Technologie firmy Sensific může pomoci odstranit zásadní problémy metody Drop-seq. Zahrnutím přístroje ODIN do procesu se může efek- tivita a rozlišení metody Drop-seq výrazně zlepšit. Jak je znázorněno na obr. 2., použitá čidla umožňují optimální monitorování procesu, výrazně zjednodušují nastavení systému a umožňují přímé řízení rychlosti tvorby kapiček a distribuci populací kapiček. Obr. 2: Znázornění zlepšení dosažených systémem ODIN. Senzor dete- kuje konfiguraci kapky v obrazovém poli a vytřídí pouze správně nakon- figurované kapičky (jedna mikročástice a jedna buňka) do analytického kanálu trigerovacími elektrodami, které vytvářejí dielektroforetické pole s napětím 1,4 kV AC a 20 kHz po dobu 3 ms pro generování kapiček frekvencí 100 Hz. V tomto schématu senzor také specificky třídí kapičky, které obsahují modré buňky. To může být založeno na fluorescenčním markeru nebo na vlastnosti, která je viditelná ve světlém poli, jako např. velikost, tvar nebo barva.
S technologií Sensific není potřeba spoléhat se pouze na statistiku, protože všechny vytvořené kapičky jsou analyzovány a správné obsazení kapičky – v každé kapičce jedna buňka a jedna mikročástice – je rozpo- znáno během několika mikrosekund. Kombinace mikrofluidního třídi- cího mechanismu integrovaného v čipu (obr. 3) a schopnosti extrémně rychlé a robustní analýzy obrazu čidel Sensific umožňuje okamžitě identifikovat a vytřídit správně nakonfigurované kapičky. Díky tomu je snadné obohatit požadovanou populaci kapiček a dosáhnout téměř 100% čistoty. Z hlediska metody Drop-seq toto poskytuje několik výhod: 1. Zvýšení účinnosti enkapsulace. Účinnost enkapsulace lze zvýšit z méně než 1 % na přibližně 14 %. To znamená, že místo sekvenování jedné ze 100 buněk může být nyní sekvenována každá zhruba šestá
36
CHEMAGAZÍN • 5 / XXXIV (2024)
Made with FlippingBook - professional solution for displaying marketing and sales documents online