ANALYTIKA VE FARMACII
ANALÝZA A PURIFIKACE SYNTETICKÝCH OLIGONUKLEOTIDŮ OD ZAČÁTKU DO KONCE – OD VÝZKUMU A VÝVOJE PO PRODUKČNÍ QA/QC
ZROSTLÍKOVÁ J., LACINA O. Altium International, s.r.o.
Syntetické oligonukleotidy jsou krátké řetězce RNA nebo DNA nejčastěji o počtu 15 až 100 jednotek nukleotidů. Mají široké využití v oblasti výzkumu, v genetice i ve forenzních vědách. Tato skupina sloučenin zahrnuje i malé interferující RNA, terapeutické antisense oligonukleotidy, aptamery a CRISPR vodicí RNA (CRISPR guide). Tyto látky se vyrábějí synteticky, často s modifikací základní kostry nebo cukru na 2´pozici kvůli stabilitě a farmakologickým účinkům. Do buňky se dodá nukleasa Cas9 spojená se syntetickou vodicí RNA (gRNA) a genom buňky je možné štěpit na požadovaném místě. CRISPR je nedávno objevená technika genetického inženýrství, kterou lze modifikovat genomy živých organismů.
Obr. 1: Agilent řešení pro analýzu oligonukleotidů
Syntéza oligonukleotidů je poměrně složitý proces, kdy při jednot- livých cyklech vzniká řada vedlejších produktů. Při vývoji a výrobě těchto látek je proto nezbytná podrobná charakterizace nečistot i cílového produktu a jeho purifikace. Charakterizace oligonukleotidů zahrnuje potvrzení jejich molekulové hmotnosti, sekvence nukleotidů, čistoty finálního oligonukleotidu a relativní kvantifikace specifických nečistot. V tomto článku se dozvíte, jaké nástroje nabízí společnost Agilent pro tuto oblast. HPLC separace oligonukleotidů Chromatografická separace oligonukleotidů se provádí metodami HPLC, nicméně samotná analýza skrývá řadu nástrah. Oligonukleotidy jsou poměrně polární a především obsahují mnoho záporně nabitých fosfá- tových funkčních skupin. Separace na běžné reverzní fázi není vhodná z důvodu malé retence. LC separace se proto provádí na silných anexech (SAX) [1,2] anebo pomocí iontopárové chromatografie na reverzní fázi (IP-RP) [3,4], s trietylaminem jako nejběžnějším iontově párovým činidlem, což je metoda potenciálně kompatibilní i s hmotnostně spek- trometrickou detekcí. Problémem je, že iontopárové činidlo zůstává dlouho v celém LC/MS systému a jeho použití není vhodné v laboratořích, kde je MS detektor využíván i pro jiné aplikace, především v režimu pozitivní ionizace. V nedávno publikovaných aplikačních poznámkách byla s úspěchem použita i separace na chromatografii s hydrofilní-lipofilní interakcí HILIC [5,6], při které se iontopárové činidlo nepoužívá. Přítomnost velmi polárních fosfátových skupin také vede k negativním sorpčním jevům v běžných HPLC systémech, které obsahují nerezové komponenty. Proto je vhodnější využívat (U)HPLC systémy z ušlechti- lých slitin bez přítomnosti železa, které se označují jako biokompatibilní, popř. bioinertní. Agilent pro tuto analýzu přímo doporučuje systém 1290 Infinity II Bio ve variantě UHPLC (1 300 bar) nebo Prime (800 bar) a kolony série AdvanceBio. Stanovení čistoty oligonukleotidů Získání vysoce čistých syntetických oligonukleotidů není snadné. Platí, že s délkou řetězce cílové molekuly klesá výtěžnost výroby a zvyšuje se podíl nečistot. Nečistoty vzniklé při syntéze zahrnují molekuly s kratším nebo naopak delším nukleotidovým řetězcem, nekompletní thiolací, případně se ztrátou bází. K dalším nečistotám patří produkty konverze fosforothioátů na fosfodiestery, produkty oxidace, enzymové nukleázové degradace nebo nečistoty s přítomností chránících skupin, používaných ve výrobě. Pro stanovení čistoty oligonukleotidů nabízí Agilent dvě ucelená řešení pomocí metod LC/UV nebo LC/MS – viz obr. 1. Co se týče MS detektoru, je zde dostačující jednoduchý kvadrupól, popř. TOF MS, který lze zároveň využít pro profilování nečistot diskutované v následujícím odstavci.
Potvrzení hmoty produktu a profilování nečistot Podrobná charakterizace vzorku obnáší nejen potvrzení hmoty cílového oligonukleotidu, ale také identifikaci a relativní kvantifikaci nečistot. Vzhledem k rozmanitosti potenciálních nečistot a jejich stopovému množství vůči hlavnímu produktu potřebujeme při profilování nečistot pokročilé analytické metody, jako je LC/MS. Zároveň se v rutinní analýze neobejdeme bez pokročilých softwarových nástrojů pro automatické zpracování a interpretaci výsledků. Software Agilent MassHunter Bio- Confirm 12 umožňuje analýzu dat pro potvrzení hmoty cílového oligo- nukleotidu a stanovení souvisejících nečistot (Target Plus Impurities, TPI). Tento postup využívá MS dat bez fragmentace, která lze měřit na jednoduchém TOF MS detektoru Agilent 6230B. Obr. 2 znázorňuje tento postup. Na obr. 3 je ilustrace zobrazení výsledků této analýzy v software BioConfirm. Podrobnosti naleznete v aplikační poznámce [7]. Obr. 2: Target Plus Impurities (TPI) analytický postup v MassHunter BioConfirm 12.0
Konfirmace sekvence oligonukleotidu Pro konfirmaci sekvence oligonukleotidu se pro cílový oligonukleotid změří MS/MS data s vysokým rozlišením a přesnou hmotou systémem LC/QTOF MS. Software MassHunter BioConfirm 12 potom „namapuje“ tato MS/MS data na předpokládané fragmenty vypočtené z uživatelem zadané sekvence nukleotidů a odpoví na otázku, jak dobře se shoduje skutečná sekvence s tou předpokládanou (pokrytí sekvence, sequence coverage). To je možné díky tomu, že z oligonukleotidové sekvence mo-
18
CHEMAGAZÍN • 5 / XXXIII (2023)
Made with FlippingBook - professional solution for displaying marketing and sales documents online